Маркеры нестабильности генома у больных ювенильным ревматоидным артритом

Сотрудники «Казанского государственного медицинского университета» подготовили статью посвященную определению состояния нестабильности генома у пациентов с ювенильным ревматоидным артритом и оценки его зависимости от биологических (возраст и пол) и клинических (форма, вариант течения, активность, продолжительность, функциональный класс заболевания и серотип больного) параметров.

Ювенильный ревматоидный артрит – артрит неустановленной причины, продолжающийся в течение 6 нед и возникший до 16-летнего возраста, при исключении других форм патологии. Заболевание нуждается в ранней диагностике и назначении адекватной терапии.

Анализ литературы показал, что спектр исследований, направленных на формирование научно-обоснованной концепции патогенеза ювенильного ревматоидного артрита, за последние годы начинает смещаться в область молекулярно-биологических разработок иммуногенетического статуса пациентов: детализируются отклонения в иммунной системе и генетических показателях, определяются алгоритмы их взаимоотношений, оценивается роль последних в механизме становления и развития заболевания. Появились сведения, что заболевание инициируется множеством экзо и/или эндогенных активных факторов, которые действуют на фоне генетической предрасположенности, постоянно поддерживая аутоиммунный ответ на компоненты синовиальной оболочки.

В патогенезе ювенильного ревматоидного артрита и других аутоиммунных заболеваний все большее внимание уделяется изучению повреждений генетического аппарата отдельных клеток и механизмов, инициирующих эти нарушения. Стимулом для такого рода исследований явилось обнаружение у больных ювенильным ревматоидным артритом высокого содержания целого ряда метаболитов, обладающих выраженной мутагенной активностью (эндомутагенов): гидроперекисей, диеновых конъюгатов, малонового диальдегида, супероксидного аниона, пероксида водорода, оксида азота, гистамина, серотонина, фактора некроза опухоли, атипичных нуклеотидов – трифосфатов. Их избыточное накопление отмечалось не только в клетках и синовиальной жидкости поврежденных суставов, но и в клетках,  дистанцированных от очага воспаления.

Все эти процессы при нормальной жизнедеятельности не представляют серьезной опасности для генома клетки. Однако в условиях нарушенного метаболизма они становятся источником повышенной генерации эндомутагенов. Высокое содержание их на фоне дизрегуляторных явлений способствует возникновению у больных ювенильным ревматоидным артритом случайных, ненаправленных мутаций ДНК в различных клетках, провоцируя появление феномена нестабильности генома. В такой ситуации повреждения функционально значимых участков ДНК могут привести к необратимому нарушению экспрессии генов, дестабилизации молекулярных свойств клетки, изменению ее функций, некрозу или апоптозу. Это особенно опасно, если в сферу действия эндомутагенов попадают клетки, формирующие и контролирующие функциональное состояние нейро-, эндокринной, сердечно-сосудистой, иммунной и других систем. При хронизации процесса массированный негативный эффект неминуемо приведет к утяжелению заболевания, снижению эффективности лечения и неблагоприятному прогнозу.

Обнаружение у больного ювенильным ревматоидным артритом повреждений ДНК на генном или хромосомном уровне позволяет ставить вопрос о наличии в патогенезе болезни генетической компоненты в виде нестабильности генома со всеми вытекающими отсюда последствиями. В специальной литературе обсуждается вопрос о формировании нестабильности генома в патогенезе соматических заболеваний, несущих аутоиммунную составляющую: системная красная волчанка, детский церебральный паралич, бронхиальная астма, заболевания вирусной этиологии. Однако публикаций, изучающих повреждения генетического аппарата клеток больных ювенильным ревматоидным артритом, не обнаружено.

Характеристика детей и методы исследования

Обследованы 95 детей, из них 68 (39 девочек и 29 мальчиков) – с различными формами ювенильного ревматоидного артрита и 12 детей, находящихся на этапе верификации диагноза и не получающих лечение. Контрольную группу составили 15 условно здоровых детей в возрасте от 3 до 16 лет. Диагноз ювенильного ревматоидного артрита устанавливали на основании клинико-анамнестических данных и результатов инструментальных исследований в соответствии с восточноевропейскими диагностическими критериями, разработанными ревматологами стран Восточной Европы и России в конце 70-х годов XX века и рекомендованных Союзом педиатров России практикующим врачам.

Исследования проводили дважды – в момент поступления больного в стационар и спустя 2–3 нед после курса лечения. Все больные были разделены на 3 группы. При классификации заболевания придерживались рекомендаций Американской ассоциации ревматологов. Выбор основывается также на том, что большинство исследователей-ревматологов едины во мнении, что существенной является триада клинических вариантов дебюта ювенильного ревматоидного артрита: системный, поли- и олигоартикулярный. У 44 (60%) больных диагностирован полиартикулярный вариант, у 20 (25%) – олигоартикулярный, у 4 (5%) – системный вариант. Во всех 3 группах преобладали девочки (56,25%). При поли- и олигоартикулярном вариантах средний возраст больных составил 10 лет, при системном варианте – 9 лет. Самому младшему ребенку было 5 лет, старшему – 16 лет. У большинства больных системным вариантом был поздний ювенильный ревматоидный артрит. Средняя длительность болезни составила 6 лет. По степени активности процесса распределение было следующим: 13 (20,3%) детей с олигоартикулярным вариантом I степени, 7 (10,9%) – с олигоартикулярным вариантом II степени, 16 (25%) – с полиартикулярным вариантом I степени, 28 (43,7%) – с полиартикулярным вариантом II степени.

Регистрация нестабильности генома в клетках человека может осуществляться различными путями. В настоящей работе для оценки нестабильности генома использовался метод, рекомендованный Международным протоколом (Human MicroNucleus project: Fenech M., 2003) для изучения особенностей и механизмов формирования индивидуальной чувствительности генома человека в норме и при различных патологиях, – оценка микроядер в бинуклеарных лимфоцитах крови детей (in vitro) в условиях цитохалазинового блока. Культивирование лимфоцитов проводили по традиционной методике. Анализировали уровень бинуклеарных лимфоцитов с микронуклеусами. Уровень двуядерных лимфоцитов, содержащих микроядра, подсчитывали в 1000 просмотренных двуядерных лимфоцитах периферической крови человека. Результаты выражены в промиллях. Количество бинуклеарных лимфоцитов с микронуклеусами у больных определяли в момент поступления детей в стационар и после лечения. Индекс пролиферации рассчитывали по формуле: (число одноядерных клеток + 2 • число двуядерных клеток + 3 • число полиядерных клеток) / число проанализированных клеток.

Цитохалазин В вводили в культуру на 44-м часу от начала культивирования фитогемагглютинин –стимулированных лимфоцитов. На 72-м часу клетки фиксировали, отмывали и прокрашивали азурэозином по Романовскому–Гимзе. Цитохалазин, ковалентно связываясь с оперенным концом актинового филамента клетки, блокирует цитокинез в лимфоцитах, стимулированных к делению фитогемагглютинином.

Особенность представленного метода в том, что он позволяет количественно учитывать много параметров. Для нас важными были два момента. Во-первых, культура лимфоцитов рекомендована ВОЗ в качестве тест-системы при оценке влияния на клетку мутагенных факторов. Это позволяет сравнить полученные результаты с данными других авторов. Кроме того, регистрация микроядер дает возможность судить не только об интенсивности процесса повреждения хромосом, но и о повреждении митотического аппарата клетки, контролирующего кинетику хромосом.

Результаты и обсуждение

При суставной форме заболевания (поли- и олигоартикулярный варианты) выделяли группу больных, не получающих базисную терапию на этапе верификации диагноза (n=12), и группу пациентов (n=64), находящихся на базисной терапии – метотрексат, нестероидные противовоспалительные препараты. Анализ результатов определения уровня бинуклеарных лимфоцитов с микронуклеусами в крови у всех обследуемых детей в активной форме заболевания показал достоверное его увеличение независимо от пола по сравнению с группой условно-здоровых детей, p<0,001. Максимальные значения данного показателя определялись при полиартикулярном варианте, достоверно отличаясь от показателей как контрольной группы (р<0,001), так и у больных с олигоартикулярным вариантом (р<0,001). Статистически значимых отличий данного показателя в зависимости от пола не обнаружено (22,3±6,0‰ – у мальчиков; 20,5±6,0‰ у девочек), соответственно (p>0,05).

После лечения через 21 день у детей с полиартикулярным и олигоартикулярным вариантами независимо от пола было выявлено достоверное и более выраженное снижение уровня бинуклеарных лимфоцитов с микронуклеусами в крови по сравнению с таковым в аналогичной группе без лечения (p<0,001). В то же время этот показатель оставался достоверно выше, чем в контрольной группе (p<0,05). Проведен сравнительный анализ уровня бинуклеарных лимфоцитов с микронуклеусами у детей от 5 до 10 лет и от 11 до 16 лет. Группы были разделены по такому принципу в связи дебютом заболевания у большинства детей в возрасте 5 лет. Максимальные значения наблюдались в возрастной группе от 5 до 10 лет (см. таблицу) как при олигоартикулярном, так и при полиартикулярном варианте (21,7±5,8 и 19,9±6,3‰ соответственно; p<0,001) и достоверно отличались от показателей в группе детей в возрасте 11–16 лет (p<0,001). Таким образом, уменьшение количества бинуклеарных лимфоцитов с микронуклеусами в крови у больных с суставной формой ювенильного ревматоидного артрита, находящихся на лечении,  является благоприятным фактором в коррекции анеугенного эффекта (образование микроядер в процессе клеточного деления, возникших при разрыве хромосом в лимфоцитах). Однако эффективность базовой терапии явно недостаточна для полного устранения признаков нестабильности генома у больных с данным заболеванием. Интересные данные получены при анализе результатов по изучению уровня бинуклеарных лимфоцитов с микронуклеусами у больных с суставной формой ювенильного ревматоидного артрита в зависимости от продолжительности заболевания. Максимальное увеличение этого показателя было выявлено в группе детей с длительностью заболевания менее 1 года по сравнению с контрольной группой, p<0,001 (рис. 1). В группе детей с длительностью заболевания больше 1 года этот показатель был достоверно ниже (при олигоартикулярном варианте – 19%, при полиартикулярном варианте – 20,5%; p<0,05). Максимальное увеличение уровня бинуклеарных лимфоцитов с микронуклеусами отмечено у больных с полиартикулярным вариантом – 23,1±6,3% (по сравнению с группой условно-здоровых детей p<0,001). Следовательно, характер выраженности повреждения генома может зависеть от клинических форм и продолжительности течения заболевания.

При анализе содержания бинуклеарных лимфоцитов с микронуклеусами в крови в зависимости от степени активности заболевания выявлено, что по мере повышения активности процесса увеличивается уровень бинуклеарных лимфоцитов с микронуклеусами по сравнению с показателями как контрольной группы (p<0,05), так и группы больных без терапии (p<0,05), что может демонстрировать тяжесть клинических проявлений. После лечения достоверное снижение содержания бинуклеарных лимфоцитов с микронуклеусами выявлено у больных со II степенью активности заболевания при обоих вариантах ювенильного ревматоидного артрита (р<0,05).

Заключение

Таким образом, изучение состояния генома у больных ювенильным ревматоидным артритом, проведенное цитогенетическим методом, показало, что статистически значимое повышение уровня бинуклеарных лимфоцитов с микронуклеусами в периферической крови может свидетельствовать о формировании у детей нового патогенетического звена – нестабильности генома. В свою очередь изучение феномена нестабильности генома при ювенильном ревматоидном артрите позволяет получить новые сведения о патогенезе этого инвалидизирующего заболевания.

Нестабильность генома при ювенильном ревматоидном артрите, тестируемая по уровню бинуклеарных лимфоцитов с микронуклеусами в крови, не зависит от пола и возраста пациентов, но зависит от формы заболевания, варианта течения, степени активности и наличия иммуносупрессивной терапии. Метод Human MicroNucleus project может применяться для изучения вероятности возникновения ювенильного ревматоидного артрита у детей с отягощенной по ревматическим заболеваниям наследственностью.

Проводимая терапия сопровождается статистически значимым снижением уровня бинуклеарных лимфоцитов с микронуклеусами у детей с ювенильным ревматоидным артритом, что является благоприятным фактором в коррекции анеугенного эффекта. Однако базисная терапия явно недостаточна для полного снятия эффекта нестабильности генома у больных с данной патологией.

Источник: Маркеры нестабильности генома у больных ювенильным ревматоидным артритом

Макарова Т.П., Ильина М.С.

Российский вестник перинатологии и педиатрии, 2019; 64:(6)

Метки: научные исследования

03.03.2021