Микробиота кишечника здоровых новорожденных детей: новые технологии диагностики — новый взгляд на процесс становления

В настоящее время не существует критериев адекватной оценки качественного и количественного состава микробиоты кишечника новорожденных детей, что не дает возможности выявить на ранних сроках патологический процесс и скорректировать его.

Специалисты ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова и ФГБУ «ЦСП» Минздрава России провели исследование, целью которого стало изучение становления микробиоты кишечника у детей, рожденных самопроизвольно и путем операции кесарева сечения, с помощью методов культуромики, протеомики и молекулярно-генетических технологий.

Проспективное исследование выполняли на когорте здоровых доношенных новорожденных. Рандомизацию проводили блочным методом, в результате которого были сформированы две группы детей: группа I — 33 – рождены самопроизвольно; группа II — 33 рождены путем операции кесарева сечения.

Все дети находились на грудном вскармливании, и в единичных случаях детей докармливали искусственными смесями. У всех матерей не было отмечено длительного безводного промежутка; антибиотики во время беременности принимали три женщины; истмико-цервикальная недостаточность имела место у четырех женщин (6%). В случае оперативного родоразрешения женщины получали амоксиклав в качестве антибиотикопрофилактики до и во время операции.

У новорожденных проводили трехкратный отбор проб фекалий: в первые сутки, в конце первой недели и конце первого месяца жизни. Образцы мекония, полученного во время первой дефекации, собранные со стерильной пеленки в стерильный пластиковый контейнер, в течение 2 ч доставляли в лабораторию и незамедлительно приступали к посеву.

Изучение состава микробиоты кишечника новорожденных проводили c использованием расширенного спектра селективных и неселективных питательных сред и инкубированием в аэробных, микроаэрофильных и анаэробных условиях.

Для выделения факультативно-анаэробных и аэробных микроорганизмов использовали колумбийский кровяной агар, хромогенную среду Brilliance, сальмонелла-шигелла-агар, декстрозный агар Сабуро (Oxoid; Великобритания), маннит-солевой агар (Himedia; Индия), среду для выявления и дифференциации Streptococcus agalactiae (CHROMagar; Франция), энтерококковый агар, агар Эндо (ФГУН «ГИЦПМ и Б»; Россия).

Идентификацию микроорганизмов осуществляли с помощью времяпролетного MALDI-TOF масс-спектрометра AutoFlex III c программным обеспечением Maldi BioTyper (Bruker Daltoniks; Германия) версии 3.0. При получении значений SCORE > 2,0 культуру считали с высокой вероятностью идентифицированной до вида. При значениях SCORE в диапазоне 1,7–2,0 культуру считали идентифицированной до рода.

При статистической обработке данных для определения различий в частоте встречаемости микроорганизмов в зависимости от способа родоразрешения использовали точный тест Фишера.

У каждого пятого ребенка меконий оказался стерильным, причем у детей II группы в 2 раза чаще по сравнению с I группой (9 и 4 соответственно; р > 0,05). У детей с положительными результатами посевов мекония выделена разнообразная микрофлора (63 вида, средний показатель видового разнообразия составил 3,8 вида на одного ребенка). Наиболее часто выделяли грамположительные факультативно-анаэробные микроорганизмы, представленные 10 родами: Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Micrococcus, Gemella, Globicatella, Granulicatella, Rothia; Corynebacterium, Bacillus.

В группе I колонизация кишечника лактобациллами оказалась значительно выше (18 и 3% соответственно; p > 0,05). Бифидобактерии чаще выделяли у детей I группы (9 и 3% соответственно; p > 0,05), ими оказались Bifidobacterium bifidum, B. longum, B. adolescentis. Бактероиды в первые сутки жизни обнаружили лишь у одного ребенка I группы. Прочие анаэробы (вейлонеллы, превотеллы и кампилобактеры) выделяли практически только во II группе.

Средний показатель видового разнообразия возрос по сравнению с первой точкой почти в 3 раза и составил 9,4 вида на одного ребенка. Как и в первые сутки жизни, в обеих группах наиболее часто встречались грамположительные факультативно-анаэробные микроорганизмы. Их титр заметно вырос: после естественных родов — до 107–1011, после кесарева сечения — до 107–1012 КОЕ/г, а частота встречаемости составила 100% в обеих группах. Увеличилась частота выделения S. aureus: у 44% детей I группы и у 55,6% детей II группы. Расширилась представленность энтерококков с двух до шести видов: Enterococcus faecalis, E. durans, E. faecium, E. gilvus, E. avium, E. gallinarum. Доминирующую позицию, как и в первые сутки жизни, занимал E. faecalis, колонизировавший кишечник большей части новорожденных в обеих группах (80% — в I группе и 88,9% — во II группе).

Видовой спектр грамотрицательной факультативно- анаэробной микрофлоры расширился с 6 до 15 видов, относящихся к семейству Enterobactеriaceae. E. coli при самопроизвольных родах по-прежнему выделяли чаще (64% — в I группе и 44,4% — во II; p > 0,05). Прочие энтеробактерии высевали примерно с одинаковой частотой в обеих группах.

Статистически достоверные различия наблюдали в представленности бифидобактерий. Если в группе I частота их встречаемости составила 84%, а титр находился в диапазоне 109–1012 КОЕ/г, то во II группе бифидобактерии выделены только у 33% в титрах 105–1012 КОЕ/г (p < 0,05). Видовой спектр бифидобактерий расширился с 3 до 7 видов: B. adolescentis, B. breve, B. dentium, B. catenulatum, B. bifidum, B. longum, B. animalis. Некоторые виды обнаружены только в одной из групп: B. adolescentis и B. catenulatum (только в I группе) и B. dentium и B. animalis (только во II группе).

К седьмым суткам жизни микробиота в значительной степени обогатилась за счет прочих облигатных анаэробов (11 родов). При этом бактероиды, представленные Bacteroides fragilis, B. ovatus, B. vulgatus, B. uniformis, Parabacteroides distasonis, выделены только у детей, рожденных самопроизвольно.

В третьей точке обследовано 50 детей: 24 ребенка из группы I и 26 детей из группы II. Cредний показатель видового разнообразия составил 10,1 вида на одного ребенка. Как и в более ранние периоды, наиболее представленной была группа грамположительных факультативно-анаэробных микроорганизмов (7 родов). Частота выделения S. aureus мало изменилась в сравнении с седьмыми сутками в I группе (58,3%) и значительно выросла во II группе (76,9%).

В составе грамотрицательной факультативно-анаэробной микрофлоры выявлено 11 видов из семейства Enterobacteriaceae и один вид неферментирующих бактерий — Stenotrophomonas maltophilia. E. coli при самопроизвольных родах по-прежнему выделялась чаще (75% в I группе и 61,5% — во II; р > 0,05). Прочие энтеробактерии несколько чаще высевали у детей II группы (66,7 и 73% соответственно; p > 0,05).

Видовой состав лактобацилл расширился до 15 видов, причем в I группе выделяли почти вдвое большее количество видов. Видовой спектр бифидобактерий увеличился на один вид B. ruminantium. Наиболее часто выделяли B. longum (58,3% в I группе и 26,9% — во II) и B. bifidum (33,3 и 34,6% соответственно).

Таким образом, на 30-е сутки жизни микробиота кишечника вне зависимости от способа родоразрешения представлена поликомпонентными ассоциациями микроорганизмов, относящихся к факультативным и облигатным анаэробам. В то же время наметились определенные различия, касающиеся облигатной и транзиторной составляющей микробиоты.

Гемолитические штаммы Enterococcus sp. и E. coli в обеих группах детей встречались с одинаковой частотой: Enterococcus sp. соответственно по 8,3% в каждой группе и E. coli — 9,5 и 9,7% соответственно. Лактозоотрицательные штаммы E. coli статистически достоверно чаще (в 8 раз) выделяли у детей II группы (19,4 и 2,4% соответственно; р < 0,05).

Для уточнения видовой принадлежности 36 изолятов бактерий (SCORE < 2,0) потребовалось секвенирование гена 16S рРНК. Для большинства изолятов результаты секвенирования гена 16S рРНК совпали с результатами MALDI-TOF масс-спектрометрии. Лишь для 5 изолятов достоверную идентификацию удалось получить только методом секвенирования гена 16S рРНК. Расхождение идентификации касалось 11 изолятов: для 7 изолятов методом MALDI-TOF масс-спектрометрии не удалось правильно определить родовую принадлежность микроорганизмов и для 4 изолятов — видовую.

Полученные авторами результаты подтверждают, что оперативное родоразрешение в определенной степени сдерживает процесс нормального становления микробиоты кишечника. В дальнейшем авторы планируют продолжить накапливать информацию о состоянии микробиоты у данной категории детей и расширить исследование, включив в него недоношенных детей, с целью определения критериев нормы кишечной микробиоты здоровых доношенных новорожденных.

Источник:

Микробиота кишечника здоровых новорожденных детей: новые технологии диагностики — новый взгляд на процесс становления Припутневич Т. В., Исаева Е. Л., Муравьева В. В., Гордеев А. Б., Зубков В. В., Тимофеева Л. А., Месян М. К., Шубина Е., Макаров В. В., Юдин С. М.

https://vestnikrgmu.ru/archive/2019/5/13/content?lang=ru

Изменения слуха у детей с брахио-ото-ренальным синдромом

Клинические особенности течения хронического пиелонефрита у детей на фоне анемического синдрома

Метки: научные исследования

10.02.2020